1. 什么是内毒素？hongkongdoll 麻豆
内毒素一种在革兰氏阴性菌细胞壁中发现的脂多糖（LPS）。它是一种典型的热原，哪怕是皮克级（10-12 g）或纳克级的（10-9 g）内毒素参加血液，也会激勉多样生物反馈。因为其有着耐热性和领略性，通过高压蒸汽不停也不行全王人使内毒素灭活，需在250℃或以上的温度下，干热不停至少半小时才能使其灭活。它存在于革兰氏阴性菌栖息的环境中（举例水，空气），即使在细菌物化后，细菌性的内毒素（LPS）仍然存在。
图1为脂多糖的结构图，如图所示，脂质A在该物资中是谨慎生物活性的主要部分，这部分的分子量约为2000。包含糖链部分在内的通盘这个词分子的分子量一般为5000到8000驾御。然则，因为内毒素是一种同期领有亲水区（糖链）和疏水区（脂质A）的分子，它能在水溶液中互相缔合，形成表不雅分子量为数十至数百万的胶束结构。有证明指出，胶束结构的变化，会影响其生物活性的强弱。
图2所示为大肠杆菌型和头陀氏菌型的脂质A的结构。从图中能看出即使菌株不同样，脂质A的基本结构在大体上仍然疏导。
图1. 脂多糖（LPS）结构清楚图
图2. 脂质A的结构（大肠杆菌型和头陀氏菌型）
2. 使用鲎阿米巴样细胞熔解物（LAL）试剂的多样内毒素检测门径
由马蹄蟹（好意思洲鲎）的阿米巴样细胞熔解物制备的试剂可用于检测细菌内毒素。如图3所示，在内毒素的参与下，级联反馈运转进行，其中C因子，一种丝氨酸卵白酶前体，起首被活化。随后接下来的是B因子的活化，B因子亦然一种丝氨酸卵白酶前体和凝固酶前体，它能将凝集原水解成凝集素，形成不溶性凝胶。在LAL测试中，内毒素不错通过三种样貌定量：对凝胶的形成进行测定，对浊度的增多进行测定，或对由合成底物证明而开释出的黄色色原体进行测定。
世俗的LAL试剂不仅与内毒素反馈，而且会与（1→3）-β-D-葡聚糖（真菌细胞壁身分）反馈，因为G因子阶梯会在LAL试剂作用下被激活。为了舍弃这种（1→3）-β-D-葡聚糖活化，在工业中通畴昔除G因子或羁系其活化，诱骗了多样内毒素特异性试剂。
市集上有着多样基于图3中的反馈机理所制得的LAL试剂以及检测体系。因此，凭证所需的准确度、测试频率、样本数量以越过他有关因素来遴荐最合适的居品是十分纷乱的。
图3. LAL试剂反馈机理
好意思国，欧洲和日本的药典中包含了三种内毒素检测门径，分离是凝胶法、比色法和比浊法，咱们会不才面的章节中胪陈，何况会先容有关的LAL试剂的特色以越过应用实例。
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(1) 凝胶法
将样本与LAL试剂在试管中羼杂，并使用干浴器，在37±1°C下，孵育60±2min，时候不要振动。加热完成后，立即逐渐地将试管歪斜180°。如若凝胶已形成并能保抓其竣工性而不变形或塌陷，则截止可详情为阳性，而如若未形成凝胶则为阴性。在检测时候，关于一系列样本，要进行多倍稀释（每每为2倍），以查验每个样品的截止是否为阳性。详情为阳性的最大灵验稀释倍数或最小浓度被称为极端。
有关试剂
在单次型试剂盒和屡次型试剂盒中王人包含LAL试剂，其中单次型试剂盒中的反馈小瓶包含了预分装好的用于单次检测的LAL试剂，而屡次型试剂盒则是将所需量的还是熔解好的LAL试剂装入到反馈瓶中。单次型试剂盒相称适用于小数样品的检测，而屡次型试剂盒则适用于样本量更多的检测。
屡次型试剂盒的使用门径式是将0.1mL还是熔解好的LAL试剂分装到反馈管中，然后再加入0.1mL样品，并将其羼杂。而单次型试剂盒的使用门径则是将0.2mL样本加入到含有事先分装好的LAL冻干试剂的反馈小瓶中。
ES-II系列
特异性内毒素LAL试剂（不会被（1→3）-β-D-葡聚糖活化），与细菌内毒素检测（BET）（日本药典）相兼容。其胶凝贤慧度为0.015 EU/mL，单次型和屡次型试剂盒均有提供。
（2）比色法
由于内毒素会使LAL试剂活化，比色法是凭证其对显色底物的证明来检测其活化。由于对硝基#苯*胺的黄色的吸光度是在405 nm波长下检测的，如若样品在约405 nm波长下具有十分大的光采纳，则不宜使用比色法。
有关试剂
Color KY 系列
内毒素特异性比色法LAL试剂，与BET（日本药典）一致性测试相兼容。与Toxinometer® 攀附使用的单次型试剂盒，以及与酶标仪和Toxinometer® 攀附使用的屡次型试剂盒，可用于动态比色测试。这些系列在咱们的试剂居品有着最高的贤慧度：检测限为0.0002 EU/mL（单次型）和0.0005 EU/mL（屡次型）。
（3）比浊法
比浊法哄骗凝胶浊度的变化来检测由内毒素引导所产生的LAL试剂的活化。它不适用于具有一定浊度的样品。
有关试剂
ES-F系列和ES-II系列
在动态比浊法测量中，不错将ES-F系列、ES-II系列与酶标仪和Toxinometer® 攀附使用。这些试剂盒不仅能获取凝胶法的截止，同期能得到动态比浊法的数据，测量时间为60 min。
3.对检测用具的条目
用于内毒素检测的通盘检测用具必须不含内毒素和β-葡聚糖。为使内毒素失活，需要在250°C下干热不停跳跃30 min。提出使用经干热灭菌的玻璃器皿。幸免使用金属用具，因为即使有小数被洗脱出的金属离子（举例铁，铝，镓，铬），也可能影响测试。而当使用一次性塑料用具（其制造商未能保证其能用于检测用途）时，查验它们是否兴奋以下条目（与玻璃器皿比拟）：1）未被内毒素羞辱; 2）不吸附内毒素; 3）无洗脱物。
4.内毒素模范品
凭证检测标的使用妥贴类型的内毒素模范品。
•需顺应BET（好意思国药典/ 欧洲药典 / 日本药典）的检测，举例药品和医疗器械的居品最终锻真金不怕火
→必须使用好意思国药典，欧洲药典或日本药典模范的内毒素国度模范品。
•对材料，工艺经过和其他有关主题的检测
→不错使用内毒素责任模范品（CSE）。
5. 样本侵略
未必候需要给与端庄步履，以预防样本对内毒素检测有潜在影响（反馈侵略）。这些侵略分为以下两种类型：
（1）对LAL试剂的侵略
•卵白变性剂（举例酸，碱，尿素，名义活性剂，有机溶剂）
•卵白酶和卵白酶羁系剂
•螯合剂（会取销反馈所需的钙和镁）
•关于比色法：着色物资（在约405 nm处具有十分大采纳的物资）
•关于比浊法：浊度
（2）对内毒素的侵略
•金属离子（举例铁，铝，镓和铬离子。即使微摩尔级别的存在也会对测试产生影响）
•名义活性剂
样本的侵略效劳不错通过进行药典中的侵略因子测试来揣摸：即通过对加标了已知量的内毒素的样本进行检测，获取加标内毒素的回收率。如若回收率在50％至200％限度内，则不错详情该样本不会变成影响，换句话说，检测所得的内毒素浓度是正确的。如若发现样本会变成影响，不错通过对样本溶液进行稀释，从而减少对测试的影响。然则，对样本溶液的稀释会擢升了由原始溶液（预稀释溶液）的浓度调换而得的内毒素浓度值。合理的稀释倍数（最大灵验稀释倍数），是凭证待检测的内毒素的所需浓度以及所用LAL试剂的检测贤慧度来详情的。欲了解反馈侵略因子和最大灵验稀释度的翔实信息，详见药典中的细菌内毒素检测。
6. Limulus ES的旨趣（内毒素特异性试剂）
图4. 鲎推行反馈级联
LAL试剂和内毒素的级联反馈机制如图4所示。如若反馈体系中存在（1→3）-β-D-葡聚糖*，会激活G因子，引起伴有凝胶化的假阳性反馈。在这种情况下，不管体系中是否存在内毒素，王人会发生反馈，意味着无法对内毒素进行特异性检测。为此，咱们研发出Wako's Limulus ES，该居品通过在反馈体系中加入过量共存的（1→3）-β-D-葡聚糖（羧甲基化凝胶多糖），从而来羁系（1→3）-β-D-葡聚糖的侵略。因此，β-葡聚糖对LAL试剂的活化受到羁系，从而使内毒素特异性检测大要进行。过量的β-葡聚糖不错羁系其自己反馈的旨趣如图5所示：β-葡聚糖和LAL试剂之间反馈的浓度限度关于通盘这个词反馈而言很窄。另一方面，内毒素和鲎试剂的反馈在很宽的浓度限度内王人会发生，何况不受大王人共存的β-葡聚糖的任何关扰。Wako的Limulus ES即是凭证这个旨趣而制作的（见图6）。
*（1→3）-β-D-葡聚糖来源于霉菌（真菌）或经纤维素滤膜过滤所得。
图5. 羧甲基化凝胶多糖和LAL反馈
使用Toxinometer®（检测时间设定为99 min）和Limulus HS进行检测。
○在99 min内检测不到凝胶的生成
●有凝胶的生成
图6. 羧甲基化凝胶多糖对使用Limulus HS和Limulus ES进行的内毒素检测的影响
A：Limulus HS
B：Limulus ES
○内毒素的系列稀释
▲含有1 μg/mL羧甲基化凝胶多糖的内毒素系列稀释
◆居品列表
居品编号
居品称号
规格
包装
295-72301
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F SINGLE TEST SENSITIVITY 0.015 EU/mL (25 LAL）
for Endotoxin Detection
25 tests
291-75701
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F MULTI TEST (without CSE)
for Endotoxin Detection
100 tests
295-51301
Limulus ES- II Single Test wako 鲎试剂ES- II Single（适用于溶胶凝胶法和动态比浊法）
for Endotoxin Detection
25 tests
299-51201
Limulus ES- II Test wako 鲎试剂ES- II （适用于溶胶凝胶法和动态比浊法）
for Endotoxin Detection
60 tests
292-51213
Limulus Amebocyte Lysate ES-II，Lyophilized 鲎试剂LAL ES-II（适用于溶胶凝胶法和动态比浊法）
for Endotoxin Detection
2 mL×5
293-75401
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F/Plate (with CSE)
for Endotoxin Detection
160 tests
297-75301
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F/Plate (without CSE)
for Endotoxin Detection
200 tests
291-53601
Limulus Color KY Single Test wako
for Endotoxin Detection
25 tests
291-53101
Limulus Color KY Test Wako
for Endotoxin Detection
60 tests
290-33771
Toxinometer® ET-6000/J Standard Set 内毒素检测仪ET-6000/J
—
1 set
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